基因芯片技术面面观

传感器技术 2019-03-23 07:00

文 | 传感器技术


基因芯片技术是生物芯片的一种,它是生命科学领域里兴起的一项高新技术,它集成了微电子制造技术、激光扫描技术、分子生物学、物理和化学等先进技术。



生物芯片

 

生物芯片是指将成千上万的靶分子(比如DNA、RNA或蛋白质等)经过一定的方法有序地固化在面积较小的支持物(如玻璃片、硅片、尼龙膜等)上,组成密集分子排列,然后将已经标记的样品与支持物上的靶分子进行杂交,经洗脱、激光扫描后,运用计算机将所得的信号进行自动化分析。



这种方法不仅节约了试剂与样品,而且节省了大量的人力、物力与时间,使检测更为快速、准确、敏感,是目前生物检测中效率高、最为敏感和最具前途的技术。根据在支持物上所固定的靶分子的种类可将生物芯片分为基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片和芯片实验室等。目前,技术比较成熟、应用最广泛的是基因芯片技术,其在基因组的表达分析、药物筛选、模拟生物的基因表达及功能研究、遗传疾病基因诊断、病原微生物的诊断等方面都有广泛的应用,是一种高效、大规模获取相关生物信息的重要手段。

 

基因芯片

 

基因芯片也称DNA微阵列,是生物芯片的一种。基因芯片原理最初是由核酸的分子杂交衍生而来的,即应用已知序列的核酸探针对未知序列的核酸序列进行杂交检测DNA芯片技术,实际上就是一种大规模集成的固相杂交。是指在固相支持物上原位合成( situ synthesis)寡核苷酸或者直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面,然后与标记的样品杂交。通过计算机对杂交信号的检测分析,得出样品的遗传信息(基因序列及表达的信息)。由于常计算机硅芯片作为固相支持物,所以称为DNA芯片。



基因芯片采用大量特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针,有规律地固定于与光电测量装置相结合的硅片、玻璃片、塑料片或尼龙基底等固体支持物上,形成二维阵列,与待测的标记样品的基因按碱基对配对原理进行杂交,从而检测特定基因。



基因探针利用核糖双链的互补碱基之间的氢键作用形成稳定的双键结构,通过测量目的基因上的光电信号来实现对样品的检测,从而使基因芯片技术成为高效的大规模获取相关生物信息的重要手段。



基因芯片技术原理

 

1、DNA探针的大量收集和纯化,基因芯片探针制备方法可以是根据基因设计特异性的PCR引物,对基因进行特异性地扩张,也可以是建立均一化的cDNA文库,通过克隆鉴定、筛选、扩增产生;

 

2、将纯化后的探针固定在片基上,首先要将基片(主要用的是玻璃片)进行特殊的化学处理,使玻璃片醛基化或氨基化,然后将纯化的探针通过显微打印或喷打在基片上,再将打印好的玻璃片进行后处理,如水合化、加热或紫外交联等;

 

3、样品的标记,标记的方法一般是采用逆转录法或随机引物延伸法等;

 

4、杂交后芯片的扫描、图像处理的采集和数据分析。


电子芯片(左)与基因芯片(右)比较

 


基因芯片的特点

 

1、高通量、多参数同步分析。目前基因芯片制作工艺可达到在1cm2的载体平面上固定数万至数十万的探针,可对样品中数量巨大的相关基因,甚至整个基因组及信息进行同步检测和分析。

 

2、快速全自动分析。在一定的条件下使样品中的靶基因片段同时与芯片的多个探针进行杂交,并采用扫描仪器测量杂交信号和分析处理数据。从而,从根本上提高了测量工作的速度和效率,也极大降低了测量工作的强度和难度。

 

3、高精确度分析。由于芯片上的每一点,即每个探针都可以精确定位和选址,加上每个探针都可以精确设计及制备,因此可以精确检测出不同的靶基因、同一靶基因不同的状态以及在一个碱基上的差别。

 

4、高精密度分析。商品化芯片制作上的精密及检测试剂和方法上的统一在一定程度上保证了芯片检测的高精密度和重现性,使不同批次乃至不同实验室之间的检测结果,可以进行有效比对及分析。

 

5、高灵敏度分析。基因芯片选用了不易产生扩散作用的载体,探针及样品靶基因的的杂交点非常集中,加上杂交前样品靶基因的扩增和杂交后检测信号的扩张,极大地提高了检测的灵敏度,可以检测出1个细胞中低至1个拷贝的靶基因,从而使检测所需的样品量大幅度减少,一般只需要10~20μL样品。

 

基因芯片的分类

 

基因芯片类型较为繁多,可以依据不同的分类方法进行分类,一般可分为以下几种:

 

1、按照载体上所添加DNA种类的不同,基因芯片可分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片两种:寡核苷酸芯片一般以原位合成的方法固定到载体上,具有密集程度高、可合成任意系列的寡核苷酸等优点,适用于DNA序列测定、突变检测、SNP分析等;其缺点是合成寡核苷酸的长度有限,因而特异性较差,而且随着长度的增加,合成错误率增加。寡核苷酸芯片也可通过预合成点样制备,但固定率不如cDNA芯片高,寡核苷酸芯片主要用于点突变检测和测序,也可用作表达谱研究。cDNA芯片是将微量的cDNA片段在玻璃等载体上按矩阵密集排列并固化,其基因点样密度虽不及原位合成寡核苷酸芯片高,但比用传统载体的点样密度要高得多,cDNA芯片最大的优点是靶基因检测特异性非常好,主要用于表达谱研究。

 

2、按照载体材料分类:载体材料可分为无机材料和有机材料两种,无机材料有玻璃、硅片、陶瓷等,有机材料由有机膜、凝胶等。膜芯片的介质主要采用的是尼龙膜,其阵列密度比较低,用到的探针量较大,检测的方法主要是用放射性同位素的方法,检测的结果是一种单色的结果。而以玻璃为介质的芯片,阵列密度高,所用的探针量少,检测方法具有多样性,所得结果是一种彩色的结果,与膜芯片相比,结果分辨率更高一些,分析的灵活性更强。

 

3、按照点样方式的不同可以分为原位合成芯片、微矩阵芯片、电定位芯片三种。

 

基因芯片制备技术

 

传统制备技术

 

由于芯片种类较多,其制备方法也不尽相同,传统的制备方法基本可分为两类:一类是原位合成,另一类是直接点样。原位合成是用于寡氨基酸,直接点样多用于大片段DNA,有时也用于寡核苷酸甚至mRNA。原位合成主要有光刻法和压电打印法两种途径。

 

  • 1. 原味光刻合成

 

其利用固相化学、光敏保护基及光刻技术得到位置确定、高度多样化的化合物集合。合成的第一步是利用光照射,使固体表面上的羟基脱保护,然后固体表面与光敏保护基保护的、亚磷酰胺活化的碱基单体接触,使一个核苷酸单体连接上去,合成只在那些脱去保护基的地方发生,这个过程反复进行直至合成完毕。这个方法最大的优点就是在一个较小的区域,可制造大量不同的探针。但是这种制备方法需要预选设计,制造一系列掩盖物,造价较高,制造过程中采用光脱保护方法,掩盖物孔径较小时会发生光衍射现象,制约了探针密度的进一步提高。



  • 2. 原味打印合成

 

此原理与油墨打印类似,不过芯片喷印头和墨盒有多个,墨盒中装的是四种碱基的液体而不是碳粉,喷印头可在整个芯片上移动,并根据芯片上不同位点探针序列的需要,将特定的碱基喷印在芯片上的特定位置。该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致,因此不需要特殊制备的化学试剂。



  • 3. 分子印章原位合成

 

其合成原理类似于传统的印章,其表面按照阵列合成的要求制作成凹凸不平的平面,依此将不同的核酸或多肽合成试剂按印到芯片片基特定的位点,然后进行合成反应。

 

  • 4. 点样法

 

与原位合成法比较,点样法较为简单,只需将预先制备好的寡核苷酸或cDNA等样品通过自动点样装置点样于经原位特殊处理的玻璃片或其他材料上。即其样品可以事先纯化,交联的方式多样;而且可以通过调节探针的浓度使不同碱基组成的探针杂交信号一致,研究者可以方便地设计、制备符合自己需要的基因芯片。但是芯片的这种制备过程中,样品浪费较为严重,对寡核苷酸的化学修饰也会增加合成成本,而且芯片制备前需要储存大量样品。

 

新的制备技术

 

  • 1. 微电子芯片

 

利用微电子工业常用的光刻技术,芯片被设计构建在硅/二氧化硅等基底材料上,如图2所示,经热氧化,制成1mm×1mm的阵列,每个阵列含有多个微电极,在每个电极上通过氧化硅沉积和蚀刻制备出样品池。将连接链亲和素的琼脂糖覆盖在电极上,在电场作用下生物素标记的探针即可结合在特定电极上。电子芯片最大特点是杂交速度快,可大大缩短分析时间,但制备复杂、成本高。



  • 2. 三维生物芯片

 

这种芯片技术主要是利用官能团化的聚丙酰氨凝胶块作为基质来固定寡氨基酸。通常的制备方法是将有活性基团的物质或丙烯酰胺衍生物与丙烯酰胺单体在玻璃板上聚合,机械切割出三维凝胶微块,使每块玻璃片上有10 000个微小的聚乙烯酰胺凝胶条,每个凝胶条可用于靶DNA、RNA或蛋白质的分析,光刻或激光蒸发除去凝胶块之间的凝胶,再将带有活性基团(氨基、醛基等)的DNA点,加到凝胶上进行交联,再将DNA样品转移到凝胶块上。

 

  • 3. 流过式芯片

 

即在芯片片基上制成格栅状微通道,设计及合成特定的寡氨基酸探针,结合于微通道内芯片特定区域。从待检测样品中分离DNA或RNA,并对其进行荧光标记,然后该样品流过芯片,固定的寡氨基酸探针捕获与之相互补的核酸,再用信号检测系统分析结果。其特点是敏感度高、速度快、价格较低。

 

当前主要几种基因芯片技术

 

光引导原位合成技术生产寡聚核苷酸微阵列

 

开发并掌握这一技术的是Affymetrix公司,Affymetrix采用了照相平板印刷技术技术结合光引导原位寡聚核苷酸合成技术制作DNA芯片,生产过程同电子芯片的生产过程十分相似。采用这种技术生产的基因芯片可以达到1×106/cm2的微探针排列密度,能够在一片1厘米多见方的片基上排列几百万个寡聚核苷酸探针。

 

原位合成法主要为光引导聚合技术(Light-directed synthesis),它不仅可用于寡聚核苷酸的合成,也可用于合成寡肽分子。光引导聚合技术是照相平板印刷技术(photolithography)与传统的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。半导体技术中曾使用照相平板技术法在半导体硅片上制作微型电子线路。固相合成技术是当前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法,技术成熟且已实现自动化。二者的结合为合成高密度核酸探针及短肽列阵提供了一条快捷的途径。

 

Affymetrix公司已有诊断用基因芯片成品上市,根据用途可以分为三大类,分别为基因表达芯片、基因多态性分析芯片和疾病诊断芯片,基因表达分析芯片和基因多态性分析芯片主要用于研究机构和生物制药公司,可以用来寻找新基因、基因测序、疾病基因研究、基因制药研究、新药筛选等许多领域,Affymetrix公司主要生产通用寡聚核苷酸芯片;疾病诊断芯片则主要用于医学临床诊断,包括各种遗传病和肿瘤等,目前Affymetrix公司生产三种商品化诊断芯片,分别为p53基因突变诊断芯片、艾滋病病毒基因基因突变诊断芯片和细胞色素P450基因突变诊断芯片。

 

微电子芯片

 

Nanogen开发了多位点电控阵列并含独立可寻址检测区域的微电子基因芯片,其基质全部以硅、锗与基础的半导体材料,在其上构建25-400个微铂电极位点,各位点可由计算机独立或组合控制。无论在芯片制造或成品芯片检测,均可通过相似微电极的电场变化来使核酸结合,引入“电子严谨度”参数使芯片检测通过靶、探针序列特征和使用者要求来控制杂交过程中的严格性。这种微电子基因芯片具有以下优点:

 

1.电场定位过程能选择性地转运带电荷DNA分子,通过每个微电极位点的电场正负、强弱变化,能准确有效地随意调控芯片表面的核酸,既可将核酸结合在微电极位点上,也可以使核酸转运出来。

 

2.通过电场变化能加快DNA杂交速率,通过导入正电场后,可以大大加快待测核酸同已知探针的结合速率,减少了杂交反应时间,同普通的“被动”杂交反应的几小时相比,这种“主动”杂交反应仅仅几秒钟就可完成。另外电场变化又可有效地去除未结合游离分子,减少未结合荧光信号干扰。

 

3.通过电子严谨度可有效地控制杂交过程中的错配度,杂交错配的程度,对不同的要求上要给以不同的电场就可以符合不同的电子严谨度,这对核酸杂交严格度可以非常灵活地控制,这可以非常准确地进行SNP检测。

 

微量点样技术

 

目前大部分生产基因芯片的公司都是使用这一方法,采用了先进更加微量的点样技术,可以点更加微量的探针。这种方法生产的芯片上探针不受探针分子大小种类的限制,能够灵活机动地根据使用者的要求制作出符合目的的芯片。由于同时有生产和检测仪器出售,使拥护能够根据自己的需要制作相应的芯片,并且价格较低,所以近期内国内将会有一定的市场。生产这种设备的公司有很多,象美国的Genomicsolutions公司、英国的BioRobotics公司、美国的Cartesian公司和加拿大的Engineering公司等。



对于微量点样技术生产的基因芯片来说从仪器组成上可以分为点样仪器、杂交装置、检测仪器和分析仪器,点样仪器是否先进决定芯片上的探针密度和结合牢固程度,虽然芯片的探针密度是一个很重要的指标,达到极高密度的探针阵列是许多芯片生产公司梦寐以求的目标,但是具体的点样密度根据使用者的目的来决定,而且还要考虑到随后的杂交和检测过程。衡量点样装置有几个比较重要的指标,如仪器整体设计、功能多样性、芯片基质多样性、点样稳定性、点样速度、点样密度等等。

 

点阵器一般采用实心或空心点样针,点样方式有非接触喷点(inkjet printing)和接触点样(Contact printing)两种方式。目前,有两种非接触喷点技术用于DNA点样,一种是用压电晶体将液体从孔中喷出的压电技术(piezoelectric technology),喷滴大小一般为50-500pl;另一种为注射器螺线管技术(syringe-solenoid technology),这种技术是通过高分辨率注射器泵和微螺线管阀门有机结合起来精确控制滴液的。

 

检测仪器也是一个重要的限制条件,如果检测仪器的分辨率不高,那么即使点样仪器制造出了很高密度的芯片也没有用,对高密度的芯片通常使用激光共聚焦显微镜和高性能的冷却CCD,二者各有利弊,须根据要求综合衡量。

 

显色和分析测定方法主要为荧光法,目前正在发展的方法有质谱法、化学发光法、光导纤维法等。以荧光法为例,当前主要的检测手段是激光共聚焦显微扫描技术和高性能的冷却CCD,以便于对高密度探针阵列每个位点的荧光强度进行定量分析。因为探针与样品完全正常配对时所产生的荧光信号强度是具有单个或两个错配碱基探针的5-35倍,所以对荧光信号强度精确测定是实现检测特异性的基础。

 

分析仪器从硬件上说只是一部高性能的计算机,但其中最重要的是分析软件,如果只是进行简单的检测或科学实验,待测样品所要分析的基因很少很简单,采用直观的观察就可以得出结论,但对于大量的基因分析或是临床检验人员使用就需要有全面智能化的分析软件辅助,这样还需要考虑到软件的升级。

 

其他技术

 

主要是美国NIH、Caliper公司和Orchidbio公司等,Orchidbio公司研制了一种毛细管微流泵芯片,在边长2英寸的芯片上集成了144个微室,分别由流入孔、反应室、循环管和废液流出孔组成,这种芯片不但可以用于基因诊断和分析,还可用于合成化学,利用芯片的微指结构,Caliper公司的芯片可以用作细胞分选器,能够利用血细胞体积和变形性等特点可以很容易地把红细胞和白细胞分开,NIH研制微型芯片反应器可以很快地完成一系列生化反应。

 

基因芯片技术应用领域

 

科研领域

 

1998年底美国科学促进会将基因芯片技术列为1998年度自然科学领域十大进展之一,足见其在科学史上的意义。它以其可同时、快速、准确地分析数以千计基因组信息的本领而显示出了巨大的威力。


这些应用主要包括基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。采用基因芯片检测基因表达的改变能够节省大量的人力物力和财力,在以前,科学家不得不重复大量的实验来观察多个基因的改变情况,如果采用传统的方法研究细胞中的上千个基因的改变几乎是不可想象的,因为必须提取首先提取细胞的核酸,而且要足够多以满足Northern杂交的需要,然后标记每一种探针,再分别进行杂交检测。


而采用基因芯片则可以使工作量成千上万倍地减少,利用基因芯片同时检测了酵母菌中6000个基因的功能,而斯坦福大学Patrick Brown领导的科研小组则成果地检测了人成纤维细胞中8600个基因的表达改变。基因芯片黑可用于基因测序,目前美国人类基因组计划正在大力发展这一技术争取能替代目前的自动测序,同现有的手工测序和自动测序相比,基因芯片测序能节省大量的试剂和仪器损耗。在基因表达检测的研究上人们已比较成功地对多种生物包括拟南芥、酵母及人的基因组表达情况进行了研究。


实践证明基因芯片技术也可用于核酸突变的检测及基因组多态性的分析,与常规测序结果一致性达到98%等的突变检测,对人类基因组单核苷酸多态性的鉴定、作图和分型、人线粒体基因组多态性的研究等。将生物传感器与芯片技术相结合,通过改变探针阵列区域的电场强度已经证明可以检测到基因的单碱基突变,通过确定重叠克隆的次序从而对酵母基因组进行作图。


杂交测序是基因芯片技术的另一重要应用。该测序技术理论上不失为一种高效可行的测序方法,但需通过大量重叠序列探针与目的分子的杂交方可推导出目的核酸分子的序列,所以需要制作大量的探针。基因芯片技术可以比较容易地合成并固定大量核酸分子,所以它的问世无疑为杂交测序提供了实践的可能性。

 

生物制药领域

 

各大药厂和生物技术公司将会使用基因芯片发现筛选新药等。采用基因芯片技术,可以大大加快人类基因组计划的工作进度,例如用于基因测序、基因表达检测和新的遗传标志如SNP定位等,这对寻找新的功能基因、寻找新的药物作用靶点和开发新的基因药物具有重要意义。采用基因芯片可以进行超乎以前想象的工作量来检测不同物种、不同组织、不同病种、不同处理条件下的基因表达改变,从而知道开发具有不同用途的的诊断试剂盒。新药在实验阶段必须通过人体安全性实验,就必须观察药物对人基因表达的影响,由于并不知道药物对那一种基因起作用,就必须对已知所有或一定范围内的基因表达都进行检测,采用基因芯片可以迅速而准确地完成这一任务,美国Tularick公司曾开发出一种用于新药,能够显著地降低低密度脂蛋白-一种能引起血管硬化的物质,随后Tularick公司的科研人员采用Syntini公司的基因芯片研究了这种新药对人体细胞基因表达的影响,发现它能显著地改变细胞的基因表达图谱,十分类似有又一种毒性反应,Tularick公司只好终止了这种药物的研发,由此公司节省了大量的投资。

 

医学诊断

 

1、在优生方面,目前知道有600多种遗传疾病与基因有关。妇女在妊娠早期用DNA芯片做基因诊断,可以避免许多遗传疾病的发生。

 

2、在疾病诊断方面,由于大部分疾病与基因有关,而且往往与多基因有关,因而,利用DNA芯片可以寻找基因与疾病的相关性,从而研制出相应的药物和提出新的治疗方法。DNA芯片的高密度信息量和并行处理器的优点不仅使多基因分析成为可能,而且保证了诊断的高效、廉价、快速和简便。

 

3、应用于器官移植、组织移植、细胞移植方面的基因配型,如HLA分型。

 

4、病原体诊断,如细菌和病毒鉴定、耐药基因的鉴定。

 

5、在环境对人体的影响方面,已知花粉过敏等人体对环境的反应都与基因有关。若对与环境污染相关的200多个基因进行全面监测,将对生态环境控制及人类健康有重要意义。

 

6、在法医学方面,DNA芯片比早先的DNA指纹鉴定更进一步,它不仅可做基因鉴定,而且可以通过DNA中包含的生命信息描绘生命体的脸型长相外貌特征。这种检验常用于灾难事故后鉴定尸体身份以及鉴定父母和子女之间的血缘关系。

 

由此可见,利用DNA芯片可以快速高效地获取空前规模的生命信息,这一特征将使DNA芯片技术成为今后科学探索和医学诊断等诸多方面的革命性的新方法、新工具。




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